聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

一、目的要求

（1）學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)

（2）學(xué)習(xí)和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù)

二、實驗原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）通過化學(xué)催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳一般可分成12～25個組分。因此適用于不同相對分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。

聚丙烯酰胺凝膠作為電泳材料的特性

人工合成聚丙烯酰胺凝膠的化學(xué)體系的組成及功能：

Acr：丙烯酰胺

Bis：甲叉雙丙烯酰胺

AP：過硫酸銨——化學(xué)催化劑

TEMED：四甲基乙二胺——加速劑

SDS是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。在含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用。

三、實驗材料

（一）試劑

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 為29:1） 稱取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去離子水溶解并稀釋至100ml，貯棕色瓶中于4℃保存，可用一個月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液  取1mol/L HCL溶液48ml、三羥甲基甲烷（Tris）36.6g，加雙蒸餾水至80ml使其溶解，調(diào)pH至8.8，然后用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液  取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加雙蒸餾水至80ml，調(diào)pH6.8，用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。

4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液   稱取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸餾水850ml，調(diào)pH至8.3，加蒸餾水到1000ml，4℃貯存。用時可做10倍稀釋。

5、10% 過硫酸銨（AP）（6）四甲基乙二胺（TEMED）或β-二甲基氨基丙腈（DMAPN）。

6、10%SDS（十二烷基磺酸鈉） 稱取SDS 10g，加蒸餾水100ml使其溶解。

7、四甲基乙二胺（TEMED）

8、上樣緩沖液  取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚藍(lán)10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。

9、考馬斯亮藍(lán)染色試劑  考馬斯亮藍(lán)R250染色液：濃度為2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸餾水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。

10、脫色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸餾水至100ml。

11、樣品：人血清。

12、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物  市售中分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。也可選擇5種以上的已知分子量蛋白質(zhì)自行配制，注意其分子量分布要能滿足需要，各種蛋白質(zhì)的濃度基本相等。

（二）儀器  圓盤電泳槽（或垂直板電泳槽）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀  、脫色搖床。

四、實驗方法

（一）準(zhǔn)備圓盤電泳槽、電泳儀。

（二）凝膠制備  按下表分別配制分離膠和濃縮膠（此量可供2人用）

分離膠(12%   5ml)        濃縮膠(5%   2ml)

ddH2O        1.6ml        1.4ml

30%混合液        2.0ml        0.33ml

1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl        1.3ml        —

1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl        —        0.25ml

10%SDS        50µl        20µl

10%Ap        50µl        20µl

TEMED        4µl        4µl

注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速用滴管灌膠

（三）灌膠

1、先將膠管（5х90mm）封好底，將配制好的分離膠液灌注入膠管內(nèi)，約70mm高度（掌握分離膠的高度），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm）。用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。要在確認(rèn)分離膠徹底凝固后才開始配制濃縮膠。

2、分離膠凝固好后，倒掉覆蓋在分離膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸凈殘留的水。將配制好的濃縮膠液灌注入膠管內(nèi)（約15mm），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm），用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。膠凝固好后，倒掉覆蓋在膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸凈殘留的水，準(zhǔn)備加樣。

（四）樣品預(yù)處理和加樣  

1、取血清0.1ml、上樣緩沖液0.9ml，混勻，在沸水中煮沸5min。

2、將膠管封底去掉，放入圓盤電泳槽中，套緊，不能有空的孔，將Tris-甘氨酸電泳緩沖液加入圓盤電泳上、下槽中，電泳緩沖液要蓋過膠管口，然后用微量加樣器（或注射器）將樣品10μl加到膠管膠面內(nèi)。

（五）電泳  上槽接負(fù)極，下槽接正極，先調(diào)電壓為120v/濃縮膠，開始電泳，當(dāng)指示染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到80v/分離膠膠，繼續(xù)電泳直至染料抵達(dá)距分離膠下端約1cm處，停止電泳，斷開電源。電泳時間約1.0~1.5h。

（六）考馬斯亮藍(lán)染色   

電泳結(jié)束后，取出電泳膠管，用長注射器針剝膠，一邊注水一邊推膠，直至膠出。將膠移至大培養(yǎng)皿中，精確量取并記錄凝膠長度和指示染料的遷移距離（分離膠上緣到染料條帶中心距離），然后將凝膠板浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中0.5-1h，再用脫色液脫色1~2天，至背景無色為止。區(qū)帶可作定性或定量分析。

（七）校正曲線的數(shù)據(jù)處理和分子量測定  精確量取并記錄染色后凝膠長度、各標(biāo)志蛋白質(zhì)和各待測蛋白質(zhì)區(qū)帶的遷移距離（分離膠上緣到各蛋白質(zhì)區(qū)帶中心）。按下式計算各蛋白質(zhì)的相對遷移率（Rm值）。

Rm =  

在半對數(shù)紙上，以各標(biāo)志蛋白質(zhì)的Rm值為橫坐標(biāo)（普通尺度），相應(yīng)的分子量為縱坐標(biāo)（對數(shù)尺刻度）作圖，即得分子量校正曲線。根據(jù)各待測蛋白質(zhì)的Rm值，查此校正曲線，可求各待測蛋白質(zhì)的相對分子量。

五、注意事項

1．制膠過程中用正丁醇封住膠面是為了阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。

2．本法也適合于其他生物樣品中蛋白質(zhì)的分析。上樣量不宜過大，否則會出現(xiàn)過載現(xiàn)象。尤其是考馬斯亮藍(lán)R250染色，在蛋白質(zhì)濃度過高時，染料與蛋白質(zhì)的氨基(－NH)形成的靜電鍵不穩(wěn)定，其結(jié)合不符合Beer定律，使蛋白質(zhì)量不準(zhǔn)確。

3．Acr和Bis有神經(jīng)毒性，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，故操作時要注意保護(hù)。

附表1  分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系

蛋白質(zhì)        核酸(RNA)

分子量范圍        適用的凝膠濃度/(%)        分子量范圍        適用的凝膠濃度/(%)

<104                20-30                <104        15–20

1-4×104        15-20        104–105        5-10

1-5×104-1×105               

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