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Co-ip染色質免疫共沉淀的詳細資料:
Co-ip染色質免疫共沉淀簡單介紹:
Co-ip染色質免疫共沉淀:Co-ip染色質免疫共沉淀技術主要應用于驗證及探尋體內環境中,蛋白質和DNA的直接相互作用,旨在探索特定蛋白質在DNA上的特定結合序列,常在研究轉錄調控以及組蛋白修飾中被應用到。
實驗過程大致為:交聯-解交聯-超聲打碎-免疫沉淀-洗滌-DNA純化-PCR檢測。
Co-ip染色質免疫共沉淀具體操作:
樣品準備:培養細胞(若樣品為組織,可先培養原代細胞);固定,或者直接活細胞送樣。
細胞固定:此步驟目的為將結合在DNA上的蛋白用共價形式交聯在所結合的位點上,避免在之后的操作步驟中脫離丟失。直接將甲醛加入細胞培養液,搖晃固定10分鐘后,迅速加入2.5M甘氨酸解交聯5分鐘,PBS洗滌,刮下細胞。
超聲打碎:此步驟目的為將長鏈的DNA打碎成200-1000bp的DNA。使用設備是超聲水浴鍋,EP管在冰水混合物中超聲,超聲后細胞懸液變得澄清透明。離心取上清。
免疫沉淀:此步驟是加入特異性抗體和對照IgG,和結合抗體的磁珠(或protein A/G)。經稀釋后,超聲產物分成兩份,分別加入特異性抗體和對照IgG,輪轉過液,第二天加入磁珠輪轉4小時。
洗滌:此步驟是減少非特異性結合。分別用稀釋緩沖液、低鹽溶液、高鹽溶液、氯化鋰溶液以及TE緩沖液洗滌共7次。用洗脫緩沖液在65℃洗脫過液。
DNA純化:將洗脫的產物用DNA純化試劑盒純化,得到50ul純化產物,用于檢測ChIP結果。
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